Curso-taller de secuenciación masiva en paralelo para el análisis de genomas pequeños

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Título :	Curso-taller de secuenciación masiva en paralelo para el análisis de genomas pequeños
Autor :	DIAZ VELASQUEZ, CLARA ESTELA VACA PANIAGUA,FELIPE
Fecha de publicación :	2018
Resumen :	La Facultad de Estudios Superiores de Iztacala (FESI) imparte siete carreras, entre las cuales Biología y Medicina comparten perfiles de egresado enfocados a las áreas de investigación biológica y de la salud, respectivamente. El perfil del egresado de estas carreras, implica el desarrollo de profesionistas en ámbitos científicos y tecnológicos, con alta competencia en tecnologías innovadoras que los apoye en su incorporación al mercado laboral y les permita servir a su comunidad. Con este interés académico proponemos este curso-taller, en el cual buscamos preparar a estudiantes de la FESI y de la UNAM en la secuenciación masiva en paralelo (SMP), una metodología de última generación que ha adquirido gran relevancia debido a sus múltiples aplicaciones. El Laboratorio Nacional (LN) en Salud de la FESI, es un área de reciente creación, altamente comprometida con los valores y plan de desarrollo de nuestra Facultad, que busca participar de manera importante en la formación de recursos humanos y la especialización de los estudiantes en áreas innovadoras que impactarán su proyección a nivel científico y profesional. Con apoyo de la infraestructura de punta del LN proponemos el presente Curso-Taller que permitirá a los estudiantes adquirir competencias mediante un flujo de trabajo teórico-práctico en las áreas: (i) Microbiología, mediante la preparación de cultivos bacterianos; (ii) Biología Molecular, mediante la capacitación en la extracción del ADN de cultivos bacterianos, la preparación de bibliotecas de ADN genómico y la secuenciación masiva de dichas bibliotecas (usando la plataforma MiSeq de Illumina del LN); y (iii) en la Bioinformática, que aplicarán para el análisis genómico de los datos obtenidos. En esta propuesta, nuestros esfuerzos están encaminados a estudiantes de los últimos semestres de las carreras de Biología y Medicina (7º y 8º Semestre), cuyos intereses académicos y profesionales se encuentren relacionados con este campo del conocimiento.
URI :	http://132.248.161.133:8080/jspui/handle/123456789/7124
metadata.dc.contributor.responsible:	DIAZ VELASQUEZ, CLARA ESTELA
metadata.dc.coverage.temporal:	2018-2019
metadata.dc.description.objective:	Capacitar a los alumnos, mediante un flujo de trabajo teórico-práctico, en la preparación de bibliotecas para secuenciación masiva en paralelo de genomas pequeños.
metadata.dc.description.hypothesis:	Este Curso-Taller busca instruir a los alumnos participantes en el uso de métodos avanzados de SMP y herramientas bioinformáticas de última tecnología, que les permita incrementar su acervo de conocimientos especializados en técnicas de microbiología, biología molecular y bioinformática. Estos conocimientos son cada vez más necesarios para los egresados de nuestra Facultad y forman parte de las nuevas tecnologías que ya son empleadas en la biotecnología, la medicina, la genética y el diagnóstico molecular. Para transmitir el conocimiento a los estudiantes emplearemos un modelo biomédico de estudio de enfermedades bacterianas y su análisis genómico, a manera de ejemplo ilustrativo de una aplicación de la SMP. Este curso está dirigido a alumnos de las carreras de Biología, Medicina o afines, que hayan cursado materias como Biología Celular y Bioquímica, Genética, Biología Molecular y/o el monográfico de Ingeniería Genética (impartido en la FESI), y en cuyos proyectos de tesis puedan beneficiarse de la SMP de genomas pequeños. Con este curso se brindará una capacitación práctica a los estudiantes, en el establecimiento de cultivos bacterianos, extracción de ADN y hará énfasis en la correcta elaboración de bibliotecas de secuenciación para su posterior análisis por SMP. Estas actividades experimentales forman parte del trabajo se realiza para detección y diagnóstico a nivel molecular de bacterias patógenas de relevancia clínica en un laboratorio de análisis clínico (público o privado) que cuente con un área de biología molecular. Como componente final de este curso, se incluirá el análisis de los datos de SMP por medio del uso de herramientas bioinformáticas especializadas en la identificación a nivel molecular de las bacterias. Colectivamente las actividades académicas planteadas en el curso permitirán la adquisición de competencias teóricas y prácticas en metodologías de SMP aplicables en el ámbito laboral de los egresados de nuestra Facultad.
metadata.dc.description.strategies:	Los alumnos recibirán una instrucción teórico-práctica de cada uno de los procesos del análisis de genomas pequeños en muestras de relevancia clínica, a manera de ejemplo de una aplicación de la secuenciación masiva en el ámbito profesional, revisando detalladamente los fundamentos teóricos de las técnicas a desarrollar. Obtención de la muestra y cultivos bacterianos Las cepas bacterianas de Escherichia coli que se utilizarán en el presente curso, se obtendrán del cepario del Laboratorio de Análisis Clínicos de la CUSI Iztacala, UNAM. Se instruirá a los alumnos en el cultivo de las bacterias en placa para aislar colonias, y en medio líquido para su posterior extracción de ADN genómico, tanto a nivel teórico como experimental. Extracción del ADN genómico El ADN genómico se obtendrá por columnas de afinidad, utilizando el kit comercial DNeasy Blood & Tissue kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizará el control de calidad al ADN obtenido, mediante su cuantificación en el Nanodrop 2000 (espectrofotómetro), verificando su pureza (cociente 260/280 > 1.87) y su integridad en geles de agarosa. El ADN genómico se cuantificará por medio de fluorometría con el kit Qubit High Sensitivity (Invitrogen) y se diluirá a la concentración de 0.2 ng/uL para continuar con el flujo de trabajo de preparación de bibliotecas. Preparación de bibliotecas La preparación de bibliotecas, se realizará en las instalaciones del Laboratorio Nacional en Salud: Diagnóstico Molecular y Efecto Ambiental en Enfermedades Crónico-Degenerativas con el kit comercial Nextera XT (Illumina). Se fragmentará 1 ng de ADN genómico de alto peso molecular por medio de transposasas acopladas a adaptadores. El ADN fragmentado estará unido covalentemente a adaptadores en sus extremos, los cuales permitirán su amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la inserción de secuencias de ADN especificas usadas como etiquetas moleculares, las cuales se encuentran en los oligonucleótidos de amplificación. Para discriminar cada muestra durante la secuenciación, se utilizarán etiquetas moleculares específicas para cada una de ellas. Las bibliotecas obtenidas por este método, serán purificadas por medio de perlas Ampure XP (Beckman Coulter), cuantificadas y diluidas para la SMP. La calidad de las bibliotecas obtenidas, se verificará mediante su perfil electroforético en el equipo Bioanalyzer (Agilent). Secuenciación Masiva en Paralelo Para la SMP, las bibliotecas se diluirán por separado a una concentración de 4 nM. Se realizará una mezcla equimolar de las bibliotecas (aproximadamente 16 muestras por corrida) y cada mezcla será tratará con hidróxido de sodio 0.2N para su desnaturalización, durante 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez desnaturalizadas las bibliotecas, se diluirán en un buffer de hibridización a un volumen final de 600 uL y a una concentración de 14 pM. Los reactivos que se utilizarán en la secuenciación vienen contenidos en un cartucho, el cual se descongela previamente y se añade la muestra en la posición marcada para la misma. El cartucho se insertará en el secuenciador y se deja corriendo la reacción por un tiempo aproximado de 25 horas. Para este curso-taller se emplearán lecturas pareadas de 2x150 pb. Análisis bioinformático Se revisarán las métricas de calidad de la corrida. Se instruirá a los estudiantes en el análisis e interpretación de los parámetros y gráficas que muestra el equipo de secuenciación MiSeq System (Illumina) para evaluar la calidad de la reacción de secuenciación. Los datos obtenidos durante la secuenciación, se analizarán utilizando la plataforma en línea de Illumina denominada Basespace. Se realizará un alineamiento de las secuencias contra el genoma de referencia bacteriano empleando el paquete GATK y su módulo BWA-MEM (Broad Institute). Los parámetros de calidad en la detección de bases y del alineamiento serán analizados con los programas FASTQC (Braham Institute) y PICARD (Broad Institute), respectivamente. Se identificarán los genotipos bacterianos y regiones genómicas de relevancia clínica presentes en las cepas analizadas, como determinantes genéticas de patogenicidad y plásmidos con resistencia a antibióticos, mediante el software KRAKEN (Johns Hopkins University).
metadata.dc.description.goals:	1.Generar de un Manual digital que incluya los contenidos del curso. 2.Producir herramientas audiovisuales (videos) de apoyo, disponibles en la página del Laboratorio Nacional, para transmitir el conocimiento teórico-práctico del curso a los estudiantes. 3.Implementar el Curso-Taller, capacitando en aspectos teóricos y prácticos a los alumnos en las diferentes metodologías planteadas: obtención de las muestras de pacientes, establecimiento de cultivos bacterianos, extracción de ADN, preparación de bibliotecas de secuenciación, secuenciación masiva en paralelo y análisis bioinformático. 4.Capacitar a los alumnos en el uso delas herramientas bioinformáticas que les permitan el análisis de los datos obtenidos en el proceso de Secuenciación Masiva en Paralelo. 5.Evaluar a los alumnos mediante un examen teórico, sobre los fundamentos y aplicaciones de la secuenciación masiva en paralelo, revisados en el curso. 6.Realizar actividades de difusión del Curso-Taller en el XXXVII Coloquio Anual de Investigación de la FES-Iztacala 20187, presentando métricas del curso (estudiantes beneficiados, número de genomas secuenciados y analizados, carreras beneficiadas, entre otras).
metadata.dc.description.selfAssessment:	El “Curso-Taller de secuenciación masiva en paralelo para el análisis de genomas pequeños” contribuyó en la transferencia de conocimiento teórico-práctico para que los estudiantes desarrollaran competencias en diversas áreas del conocimiento entre las cuales destacan: a) la toma de muestra y realización de cultivos bacterianos (Área de Microbiología), b) la extracción de ADN genómico y preparación de bibliotecas para su secuenciación en la plataforma MiSeq de Illumina (Área de Biología Molecular), y c) en el análisis bioinformático de los datos obtenidos (Área de Bioinformática). La conjunción de estas áreas les proporcionó a los alumnos un conocimiento interdisciplinario de los aspectos teóricos y prácticos, mediante la discusión estructurada de los contenidos del curso, realizada después de las presentaciones de los profesores; así como a través del desarrollo de las técnicas de laboratorio. Todos los alumnos participaron activamente en la construcción del conocimiento, por lo que considero que el Curso-Taller cumplió exitosamente el objetivo planteado. Para conocer mejor la opinión de los estudiantes se realizó una encuesta de satisfacción anónima enfocada en 4 componentes esenciales del curso: (1) las instalaciones, (2) los profesores, (3) la información brindada y (4) si recomendarían el curso a otras personas. Resultados de la encuesta de satisfacción: 1. 81% de los estudiantes piensa que las instalaciones del LN-FESI son suficientes, 19% que son justas 2. 100% de los participantes considera que el personal que impartió el curso tiene la experiencia y conocimientos necesarios 3. 90.9% de los estudiantes considera que la información brindada en el curso es suficiente, 9.9% que es justa 4. 100% de los estudiantes recomendaría el curso a otros compañeros Con base en estas métricas, podemos concluir que el curso cumplió satisfactoriamente con los 4 elementos encuestados.
metadata.dc.description.goalsAchieved:	1.- Se realizó un manual digital con los contenidos del curso. 2.- Se realizaron 3 herramientas audiovisuales que incluyen los contenidos del curso: presentaciones del curso, material y videos de apoyo. Se anexarán en la página del Laboratorio Nacional una vez que el material haya sido revisado y aprobado. 3.- Se llevó a cabo el curso-taller impartido del 12 al 19 de junio del 2018 en las instalaciones del Laboratorio Nacional. 4.- Se realizó un análisis bioinformático a partir de los datos de secuenciación obtenidos en el curso. El flujo del análisis bioinformático se describe en el manual. 5.- Se llevó a cabo la evaluación del conocimiento teórico del curso de los alumnos mediante un examen escrito. Asimismo, para evaluar la opinión de los alumnos sobre el curso se aplicó una encuesta de satisfacción. 6.- Los datos y análisis bioinformático obtenidos en el Curso-Taller se presentaron en el XXXII Congreso Nacional de Bioquímica en el mes de noviembre del 2018, asistiendo con algunos de los estudiantes para su presentación. La difusión en el XXXVII Coloquio Anual de Investigación no fue posible realizarla, ya que se traslaparon las fechas de registro para el Coloquio con la impartición del curso. 7.- También se realizaron presentaciones y discusiones de resultados por equipo de trabajo, coordinadas por la responsable técnico del proyecto.
metadata.dcterms.provenance:	F.E.S. Iztacala
metadata.dc.subject.DGAPA:	Biotecnología y genómica
metadata.dc.type:	Proyecto PAPIME
metadata.dc.contributor.coresponsible:	VACA PANIAGUA,FELIPE
Aparece en las colecciones:	2. Área de las Ciencias Biológicas, Químicas y de la Salud

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